• <span id="re8h1"><video id="re8h1"><strike id="re8h1"></strike></video></span>
      <mark id="re8h1"></mark>

      1. 
        

        <mark id="re8h1"><u id="re8h1"></u></mark>

              <mark id="re8h1"></mark>

              IHC

              您现在的位置:首页 - 技术中心 - 实验方法 - IHC

              免疫组化常见问题原因分析

              问题

              可能原因

              验证或解决办法

               

               

               

               

               

               

               

               

              无染色

              一抗和二抗不匹配

              使用针对一抗的二抗(如一抗来自兔,二抗为抗兔抗体)

              没有足够的一抗与目标蛋白结合

              使用低稀释度抗体。延长4℃孵育时间(如过夜)。

              抗体的天然结构(3D形态)受损不适用于IHC

              用天然(非变性的)WB法检测抗体,确保抗体没被损坏。

              由于不当储存、稀释或反复冻融造成一抗/二抗试剂盒失效

              做阳性对照确认一抗/二抗试剂盒的有效性。

              靶组织中没有目标蛋白

              参照抗体供应商的建议做阳性对照。

              组织中没有足够的目标蛋白

              应用信号放大操作。

              没有避光保存二抗

              避免将二抗处于光照下

              脱蜡不彻底

              延长脱蜡时间,更换二甲苯。

              固定步骤(使用福尔马林和多聚甲醛固定剂)修饰了抗体识别表位

              抗原修复法暴露出抗原表位,缩短固定时间。

              蛋白位于细胞核内(核蛋白),抗体不能穿透核膜

              在封闭液和抗体稀释液中加入通透剂。

              PBS缓冲液被细菌污染后破坏了靶蛋白的磷酸根

              在抗体PBS储存液中加入0.01%叠氮化合物,或使用新鲜无菌的PBS。

               

               

               

               

               

               

               

               

              高背景

              没有封闭非特异性结合或封闭不充分

              延长封闭时间,并考虑改换封闭剂。建议用10%正常血清封闭切片1小时或1-5% BSA封闭培养细胞30分钟。

              一抗浓度过高

              滴定法寻找到最佳抗体浓度,或在浓度较低抗体中延长孵育时间(最好是缓慢而准确地结合)。

              孵育温度过高

              4°C孵育切片或细胞。

              二抗发生了非特异性结合(被损坏)

              不加一抗,做二抗对照。

              组织冲洗不彻底,有固定剂残留

              所有步骤都要用PBS充分洗涤。

              存在内源性过氧化物酶活性

              用酶抑制剂如抑制碱性磷酸酶的盐酸左旋咪唑(2mM),或抑制过氧化物酶的H2O2(0.3% v/v)。

              固定过度(固定剂用福尔马林和多聚甲醛)导致抗体识别抗原位点被修饰

              改变抗原修复方法,缩短与抗原修复液的孵育时间。

              信号过度放大(信号放大技术)

              缩短信号放大孵育时间,稀释信号扩大试剂盒。

              染料与PBS在细胞/组织中相互作用(酶检测法)

              用Tris缓冲液冲洗切片后,再与底物孵育。孵育后,Tris缓冲液再次冲洗细胞/切片。

              通透作用破坏膜并除去了膜蛋白

              去除缓冲液中的通透剂

              底物过量(酶检测法)

              缩短底物孵育时间

               

               

               

              非特异性染色

              一抗/二抗浓度过高

              降低抗体浓度和或缩短孵育周期。对比不表达目标蛋白细胞的信号强度。

              存在内源性过氧化物酶活性

              用酶抑制剂如抑制碱性磷酸酶的盐酸左旋咪唑(2mM),或抑制过氧化物酶的H2O2(0.3% v/v)。

              一抗与被染组织同源(如用鼠一抗测鼠组织),加二抗后,二抗会与同源的所有组织结合

              应用与组织非同源的一抗

              切片/细胞变干

              保持切片/细胞湿度,切勿变干。

              分享到:
              返回
              香蕉久这里只精品99re66 <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <文本链> <文本链> <文本链> <文本链> <文本链> <文本链>