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        流式细胞术

        您现在的位置:首页 - 技术中心 - 知识库 - 流式细胞术

        流式辅助试剂、工具

        流式细胞技术分析的过程中,有很多因素会影响实验结果:样本的处理、荧光补偿的调节、Fc受体的阻断、活细胞和死细胞的鉴别等。

        eBioscience公司提供流式染色缓冲液、细胞固定液、细胞破膜剂、细胞刺激剂、细胞阻断剂、FcR抗体、红细胞裂解液、细胞活性染料、细胞计数微球、荧光补偿微球等。为您的流式实验提供更稳定的结果。

         

        流式Buffer

        Intracellular Staining Buffer Selection

        Antigen

        Foxp3 Staining Buffer Set

        Fixation & Permeabilization

        HUMAN

         

         

         IFNy

         *

         YES

         IL-1a

         nt

         YES

         IL-1b

         nt

         YES

         IL-2

         nt

         YES

         IL-4 

         *

         YES

         IL-5 

         nt

         YES

         IL-6

         nt

         YES

         IL-9

         nt

         YES

         IL-10 

         *

         YES

         IL-12

         nt

         YES

         IL-13

         nt

         YES

         IL-17A

         YES

         YES

         IL-17F

         nt

         YES

         IL-21

         *

         YES

         IL-22

         *

         YES

         Granzyme B

         nt

         YES

         Perforin

         nt

         YES

         TNFalpha

         YES

         YES

         Eomes

         YES

         NO

         Foxp3

         YES

         NO

         Gata-3

         YES

         NO

         RORy(t)

         YES

         NO

         T-Bet

         YES

         NO

         

         

         

         MOUSE

         

         

         IFNy

         YES

         YES

         IL-1b

         nt

         YES

         IL-2

         YES

         YES

         IL-4

         *

         YES

         IL-6

         nt

         YES

         IL-10

         *

         YES

         IL-17A

         YES

         YES

         IL-17F

         YES

         YES

         IL-21

         NO

         YES

         IL-22

         *

         YES

         Granzyme B

         YES

         YES

         Perforin

         YES

         YES

         TNFalpha

         YES

         YES

         Eomes

         YES

         NO

         Foxp3

         YES

         NO

         Gata-3

         YES

         NO

         Nanog

         YES

         NO

         Oct 3/4

         YES

         NO

         RORy(t)

         YES

         NO

         T-Bet

         YES

         NO

        nt = Not tested

        YES = Staining compatible with this buffer system

        NO = Staining not compatible with this buffer system

        *Staining is possible with the Foxp3 Staining Buffer Set, although in some cases a reduction in brightness has been observed. No change in the percentage of positive cells has been observed.

         

         

        磷酸蛋白特异性流式抗体Buffer选择指南

         Target

         Clone

        IC fix/perm

         Foxp3

         IC fix/methanol

         pSTAT1 (Y701)

         KIKSI0803

        -

         -

         +++

         pSTAT4 (Y693)

         4LURPIE

        -

         -

         +++

         pSTAT5 (Y694)

         SRBCZX

        -

         -

         +++

         pSTAT6 (Y641)

         CHI2S4N

        -

         -

         +++

         pSrc (Y418)

         SC1T2M3

         ++

         ++

         +++

         pZAP-70/SYK Y319/Y352

         n3kobu5

         ++

         ++

         +++

         pSYK (Y348)

         moch1ct

         ++

         ++

         +++

         pBTK/ITK (Y551/Y511)

         M4G3LN

         ++

         ++

         +++

         pERK1/2 (T202/Y204)

         MILAN8R

        -

          -

         +++

         pNFkB p65 (S529)

         B33B4WP

         +++

          -

         +++

         pS6 (Y235/Y236)

         cupk43k

         +++

          ++

         +++

         pH2AX (S139)

         CR55T33

        -

          +++

         +++

         

        细胞刺激/阻断剂

        细胞刺激:未活化的细胞所分泌的细胞因子很少,用流式细胞术很难检测出来,因此在检测前需要刺激淋巴细胞使其活化。eBioscience提供多种细胞刺激物:ConA、LPS、PMA、PHA-L 

        细胞因子转运抑制剂: 细胞在活化后,分泌的细胞因子会转运到细胞外。流式检测只能对细胞表面或细胞内部的抗原进行检测,因此必须阻止细胞因子分泌到细胞外,使其聚集在细胞内。常用的阻断剂有BFA和Monensin。

        Mouse Cytokines: Intracellular Staining Quick Guide

        Mouse Cytokine

        Cell Source

        Activation

        Incubation Time

        Restimulation

        Intracellular Block

        Antibody

        GM-CSF

        mouse spleen

        ConA (3ug/mL) (2d)/IL-2 (20ng/mL)+IL-4 (20ng/mL) (3d)

        2d/3d

        anti-CD3 (10ug/mL immobilized) + anti-CD28 (2ug/mL soluble) 5hr

        Brefeldin A

        MP1-22E9

        IFN-gamma

        mouse spleen

        ConA (3ug/mL) (2d)/IL-2 (20ng/mL)+IL-4 (20ng/mL) (3d)

        2d/3d

        anti-CD3 (10ug/mL immobilized) + anti-CD28 (2ug/mL soluble) 5hr

        Brefeldin A

        XMG1.2

        IL-1 alpha

        mouse PEC

        mIFNγ (100ng/mL) (2hr)/LPS (100ng/mL)(22hr)

        2hr/22hr

        -

        Brefeldin A

        ALF-161

        IL-1 beta

        mouse PEC 

        LPS (100 ng/mL) (22hr)

        22hr

        -

        Monensin

        NJTEN3

        IL-2

        mouse spleen

        ConA (3ug/mL) (2d)/IL-2 (20ng/mL)+IL-4 (20ng/mL) (3d)

        2d/3d

        anti-CD3 (10ug/mL immobilized) + anti-CD28 (2ug/mL soluble) 5hr

        Brefeldin A

        JES6-5H4

        IL-4

        mouse spleen

        Th2 polarized

        6d

        PMA (50 ng/mL) + Ionomycin (1 ug/mL) 5hr

        Brefeldin A

        BVD6-24G2,
        11B11 

        IL-5

        mouse splenic CD4

        ConA (3ug/mL) (2d)/IL-2 (20ng/mL)+IL-4 (20ng/mL) (3d)

        2d/3d

        immobilized) + anti-CD28 (2ug/mL soluble) 5hr

        Brefeldin A

        TRFK5

        IL-6

        mouse PEC

        LPS (100 ng/mL) (22hr)

        22hr

        -

        Monensin

        MP5-20F3

        IL-10

        mouse spleen

        ConA (3ug/mL) (2d)/IL-2 (20ng/mL)+IL-4 (20ng/mL) (3d)

        2d/3d

        anti-CD3 (10ug/mL immobilized) + anti-CD28 (2ug/mL soluble) 5hr

        Brefeldin A

        JES5-16E3,
        JES5-2A5 

        IL-12/IL-23 (p40)

        mouse PEC

        LPS (100 ng/mL) (22hr)

        22hr

        -

        Brefeldin A

        C17.8

        IL-13

        mouse spleen

        Th2 polarized

        6d

        PMA (50 ng/mL) + Ionomycin (1 ug/mL) 5hr

        Brefeldin A

        eBio13A

        IL-17A

        mouse spleen

        Th17 polarized

        6d

        PMA (50 ng/mL) + Ionomycin (1 ug/mL) 5hr

        Monensin

        eBio17B7

        IL-17F

        mouse spleen

        Th17 polarized

        6d

        PMA (50 ng/mL) + Ionomycin (1 ug/mL) 5hr

        Monensin

        eBio18F10 

        IL-21

        mouse spleen

        Th17 polarized

        9d

        PMA (50 ng/mL) + Ionomycin (1 ug/mL) 5hr

        Monensin

        FFA21

        IL-22

        mouse spleen

        Th17 polarized

        12d

        PMA (50 ng/mL) + Ionomycin (1 ug/mL) 5hr

        Brefeldin A

        IL22JOP

        IL-23 p19

        mouse bone marrow

        mGM-CSF (40 ng/mL)

        8d

        LPS (1 ug/mL) (24 hr)

        Monensin

        fc23cpg

        MCP-1/ CCL2

        mouse PEC

        LPS (100 ng/mL) (24hr)

        24hr

        -

        Brefeldin A

        2H5

        TNF alpha

        mouse spleen

        ConA (3ug/mL) (2d)/IL-2 (20ng/mL)+IL-4 (20ng/mL) (3d)

        2d/3d

        anti-CD3 (10ug/mL immobilized) + anti-CD28 (2ug/mL soluble) 5hr

        Brefeldin A

        MP6-XT22,
        TN3-19 

        Annotations: mouse PEC=mouse thioglycolate-elicited peritoneal macrophages; ConA=Concanavalin A; Iono=Ionomycin; LPS=Lipopolysaccharide; PMA=Phorbol Myristate Acetate; 2d=2 day culture; 5hr=5 hour culture

         

        Human Cytokines: Intracellular Staining Quick Guide

        Human Cytokine

        Cell Source

        Activation

        Incubation Time

        Restimulation

        Intracellular Block

        Antibody

        G-CSF

        PBMC

        LPS (1 ug/mL)

        24hr

        -

        Monensin

        8F5CSF

        GM-CSF

        PBMC

        PMA (30-50ng/mL)/Iono (1ug/mL)

        5hr

        -

        Monensin

        BVD2-21C11

        IFN gamma

        PBMC

        PMA (30-50ng/mL)/Iono (1ug/mL)

        5hr

        -

        Brefeldin A

        4S.B3

        IL-1 alpha

        PBMC

        LPS (1 ug/mL)

        24hr

        -

        Monensin

        364/3B3-14, CRM8

        IL-1 beta

        PBMC

        LPS (100ng/mL)

        4hr

        -

        Brefeldin A

        CRM56

        IL-1RA

        PBMC

        LPS (100ng/mL)

        24hr

        -

        Brefeldin A

        CRM17

        IL-2

        PBMC

        PMA (30-50ng/mL)/Iono (1ug/mL)

        4-6hr

        -

        Brefeldin A

        MQ1-17H12

        IL-4

        PBMC

        PMA (30-50ng/mL)/Iono (1ug/mL)

        4-6hr

        -

        Brefeldin A

        8D4-8

        IL-5

        CD4

        Th2 polarizing cultures

        6d 

        PMA (50ng/mL) + Ionomycin (1ug/mL) (5hr)

        Brefeldin A

        TRFK5, JES1-5A10

        IL-6

        PBMC

        LPS (100ng/mL)

        24hr

        -

        Brefeldin A

        MQ2-13A5

        IL-9

        CD4

        Th2 polarizing cultures

        6d

        PMA (50ng/mL) + Ionomycin (1ug/mL) (5hr)

        Monensin

        MH9A4

        IL-10

        CD4

        Th2 polarizing cultures

        6d

        PMA (50ng/ml) + Ionomycin (1ug/ml) (5hr)

        Monensin

        JES3-9D7

        IL-12/ IL-23 (p40)

        PBMC

        hIFN gamma (100ng/mL) (2hr)/LPS (100ng/mL) (22hr)

        2hr/22hr

        -

        Brefeldin A

        C8.6

        IL-13

        CD4

        anti-CD3 (10ug/mL, immobilized) + anti-CD28 (2ug/mL, soluble) + IL-2 (10ng/mL) + IL-4 (20ng/mL) (2d); IL-2 (10ng/mL) + IL-4 (20ng/mL) (3d)

        2d/3d

        PMA (5ng/ml) + Ionomycin (500ng/ml) (4hr)

        Brefeldin A

        PVM13-1

        IL-17A

        PBMC

        Th17 polarizing cultures

        6d

        PMA (50ng/ml) + Ionomycin (1ug/ml) (5hr)

        Brefeldin A

        eBio64CAP17,

        eBio64DEC17

        IL-21

        PBMC

        PMA (30-50ng/mL)/Iono (1ug/mL)

        4-7hr or 12-18hr

        -

        Brefeldin A

        eBio3A3-N2

        IL-22

        CD4

        Th17 polarizing cultures

        6d

        PMA (50ng/ml) + Ionomycin (1ug/ml) (5hr)

        Brefeldin A

        IL22JOP

        IL-23 p19

        PBMC

        hGM-CSF (40ng/mL) +hIL-4 (40ng/mL)

        6d

        LPS (1ug/mL) (24hr)

        Monensin

        23dcdp

        MCP-1/ CCL2

        PBMC

        LPS (1ug/mL)

        24hr

        -

        Monensin

        2H5,

        5D3-F7

        RANTES/ CCL5

        PBMC

        LPS (1ug/mL)

        24hr

        -

        Monensin

        VL1

        TNF alpha

        PBMC

        PMA (30-50ng/mL)/Iono (1ug/mL)

        5hr

        -

        Brefeldin A

        MAb11

        TNF beta

        PBMC

        Th1 polarizing cultures

        6d

        PMA (50ng/mL) + Ionomycin (1ug/mL) (5hr)

        Monensin

        359-81-11

        Annotations: Iono=Ionomycin; PMA=Phorbol Myristate Acetate; LPS=Lipopolysaccharide; 2d=2 day culture; 5hr=5 hour culture; LPS for activation of human PBMC obtained from Sigma (#L-8274)

         

        Non-Cytokine Proteins: Intracellular Staining Quick Guide

        Antigen

        Antibody

        Mouse/Rat Bcl-2

        10C4

        Mouse CTLA-4 (CD152)

        UC10-4B9

        Human CTLA-4 (CD152)

        14D3

        Human/Mouse/Rat Cytochrome C

        6H2

        Human Foxp3

        PCH101

        Mouse Foxp3

        FJK-16s

        GATA3

         

        Mouse/Human Granzyme B

        eBioGrB

        House Langerin (CD207)

        eBioRMUL.2

        Human Nanog

        hNanog.1

        Human PCNA (Proliferatin Cell Nuclear Antigen)

        PC10

        Mouse Perforin

        eBioOMAK-D

        Human Perforin

        dG9

        ROR gamma

         

        Mouse SLP-76

        MS76

        Human SLP-76

        HS76

        Human/Mouse T-bet

        eBio4B10 (4B10, 4-B10)

        Human TLR3

        TLR3.7

        Mouse TLR9

        M9.D6

        Human TLR9

        eB72-1665

        Mouse/Human ZAP-70

        1E7.2

        Fc受体阻断剂 

        Fc受体是指细胞膜表面能与免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM、IgE和IgD)Fc片段结合的受体。目前已鉴定明确属于CD抗原的Fc受体有FcγR(CD64、CD32、CD16)、FcαR、FcεR。FcR能够与抗体的Fc段结合,在检测时产生假阳性。 使用FcR阻断剂,可以消除假阳性,降低检测背景,获得更清晰的结果。其广泛存在于NK细胞、肥大细胞、巨噬细胞、中性粒细胞的表面。

        用Mouse IgG2a Isotype Control FITC (cat.11-4724) (左图) or Mouse IgG2bIsotype Control FITC (cat. 11-4732) (右图)染U937细胞,没有用Human Fc gamma R-Binding Inhibitor预处理的是紫色底纹,用Human Fcgamma R-Binding Inhibitor预处理的是蓝线,红线是U937细胞自发荧光。

         

         

        细胞计数:123count eBeads ™

         

        ² 在流式平台上计数细胞

        ² 利用抗体标记细胞并利用123count eBeads计算该细胞群数量

        ² 可同时并用FVD细胞存活染料标记活细胞计数

         

        应用领域

        ² 全血细胞计数

        ² 流式细胞仪计数功能验证

        ² 精子浓度计数

        ² 可并用细胞存活染料7-AAD,PI或FVD计数细胞存活率

        ² 使用磁珠细胞分选试剂盒后计算细胞分选产率与纯度

         

        123counteBeads 使用方式

        • 加入123count eBeads TM

        • 选定待计数的细胞

        • 公式计算细胞浓度

         

        ² 加入 * 已知浓度的123count eBeads 进未知浓度的细胞样本

        ² 流式细胞仪同时读取细胞与123count eBeads

        ² 公式计算细胞浓度如下

         

        1. 当细胞与123count eBeads 体积比为1:1混合时

        实际细胞数=流式细胞仪显示细胞数量÷流式细胞仪显示eBead数量× eBead 标示浓度

         

        2. 如混合体积比不是1:1时

        实际细胞数=(流式细胞仪显示细胞数量 X eBead体积)÷(流式细胞仪显示eBead数量 X 细胞体积)X eBead 标示浓度

         

        *每管123count eBeads TM 标示有该管内eBead的浓度


        全血CD4实际细胞计数示范

        = (流式细胞仪显示细胞数量/流式细胞仪显示eBead数量) X eBead标示浓度

        = (541个细胞/1009 eBeads) X 998 eBeads/ul

        = 535个细胞/ul

         

         

        调节荧光补偿的利器——荧光补偿微球

        eBioscience抗体捕获微珠是球状的,可以和荧光抗体结合,作为流式实验的补偿对照。

        抗体捕获微珠分为阳性和阴性,阳性微珠能捕获所有的小鼠、大鼠或仓鼠抗体,阴性微珠不会和抗体反应。当荧光共轭抗体加到微珠上,就可以区分出阴阳性微珠,阳性微珠可以作为多色流式实验的单色补偿对照。

         

        优点:

        • 通常荧光都比样本表达要强

        • CV值小,几乎没有背景荧光

        • 和你实际染色的荧光抗体结合

        • 不需要使用珍贵的样本

        • 使用简单

         

        OneCompeBeads和小鼠、大鼠、仓鼠的免疫球蛋白轻链反应,对488nm蓝色,532nm绿色,561nm黄绿色和633 - 640 nm红色激光所激发的荧光染料的光谱进行补偿。可兼容eFluor® 450,但是对405 nm紫色激发的光谱不能很好的补偿。

         

        UltraComp eBeads和小鼠、大鼠、仓鼠的免疫球蛋白轻链反应,能对355nm紫外,405nm紫色,488nm蓝色,532nm绿色,561nm黄绿色和633 - 640 nm红色激光所激发的荧光染料的光谱进行补偿。

         

        将流式常用的13种不同的PE(见左图),eFluor450(见右图)共轭单克隆抗体和UltraComp eBeads混匀,Beads捕获0.25 ug抗体后上流式细胞仪分析,每个直方图代表一种染色抗体(图右边是克隆和同型)。

         

        实验所需材料:

        12x75 mm 圆底试管

        直标抗体

        流式染色缓冲液 (eBioscience Cat. No.00-4222)

         

        实验操作流程:

        准备单色补偿对照

        1、 每种荧光染料标记一个管。

        2、 微珠通过反复颠倒或涡旋混匀,混匀时间不低于10min。

        3、 每个管里加一滴UltraComp eBeads。

        4、 每个管里加少量共轭抗体。

        5、 用移液枪吸打或涡旋短暂混匀。

        6、 2-8℃避光孵育15-30min。

        7、 每管加2mL流式染色缓冲液后400-600 ×g离心3-5min。

        8、 弃去上清液,加0.2-0.4mL流式染色缓冲液。

        9、 分析前用移液枪抽打或涡旋短暂混匀。

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